液晶空间光调制器在双光子及三光子显微成像中的应用
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摘要 诸如可变形反射镜，液晶空间光调制器(SLM)和柔性聚焦透镜之类的波前成形装置在显微成像领域被广泛的用于像差校正，体积成像和可编程神经元激发。 其中液晶空间光调制器(SLM)是高分辨率的相位调制器，能够创建复杂的相位图，以在三维(3D)体积内可实现任意的光束偏转，可实现三维(3D)体积重塑。 Meadowlark Optics(MLO)公司最新的SLM将面填充率从83.4%提高到96%，并将分辨率从512 x 512像素提高到1920 x 1152像素，同时在1064 nm处达到300 Hz的液晶响应时间(0-2π)和845Hz的帧频，可覆盖波段：850-1650nm。 本文总结了Meadowlark Optics公司新的SLM的功能，以及SLM在双光子及三光子显微微镜成像应用中的优势。 关键词: 高响应速度，高分辨率，高效率，空间光调制器，LCOS, SLM ,液晶空间光调制器，双光子显微镜，三光子显微镜 介绍： 在3D体积中监控和操纵神经元回路的发射模式的需求推动了用于神经科学的高级双光子显微镜的发展。扫描双光子显微镜使用谐振(resonant stages)，或使用声光偏转器光栅扫描建立一个图像。这种方式可实现50 kHz的扫描速率。然而，用这种方法难以实现同时多点刺激，因为激光需要停留在每个位置收集足够的光子以产生可用的图像或调节活动。试图通过增加峰值激发强度来避免这种情况是基本上受到限制的，因为高功率激光会引起神经元的光损伤和荧光团的光漂白。此外，传统显微镜仅限于对二维表面进行成像，而神经回路具有三维结构。深度扫描可用于构建3D图像，但速度非常慢，因为它通常通过以大约20 Hz的速率扫描物镜来实现。这不足以监测在一毫秒的时间尺度上发生的神经活动。对于光遗传学研究，需要能够在3D空间中动态和任意形成多个焦点的显微镜以监视和操纵发射模式，并且显微镜必须能够进行3D成像以捕获神经元电路的响应。 在扫描双光子/三光子显微镜的激发路径中添加液晶空间光调制器(SLM)，可以将激发源分成几百个独立的焦点，并以高达300 Hz的频率重新配置焦点的3D位置。因此，使用SLM可以传递光线，同时可激发多个3D位点的神经元，然后将目标细胞定位在一个体积内以监测神经回路对刺激的反应。这使得在大量细胞群中监测和操纵神经元活动的过程可同步进行。 Yuste首次证明了SLM在光遗传学中的应用潜力，它开发了一种基于SLM的原型显微镜，可以同时激发脑切片中的多个神经元。在那项工作中，Yuste同时在几十个神经元中成像并检测动作电位，帧频为66 Hz。这对于神经科学界来说是一个重大进步，但是当时Yuste可用的SLM限制了这项工作。 这项工作推动了先进的SLMs的发展，以提高分辨率以最大化可研究的大脑的体积，改善功率处理以增加一次可照亮的神经元的数量，并且提高液晶的响应时间，使得激励时间可以匹配神经电路动态过程。Meadowlark Optics(MLO)公司最新的HSP1920型SLM分辨率从512 x 512像素提高到1920 x 1152像素，同时在1064 nm处达到300 Hz的液晶响应时间(0-2π)和845Hz的帧频。 横向/轴向激发 为了使SLM激发一定体积内的神经元，使用SLM作为成像的振幅调制器是不够的。相反，必须将SLM用作相位调制器，并且将所需激励模式的傅立叶变换的全息图写入SLM。使用过渡镜，使SLM成像到物镜的后焦平面。为了利用物镜的全数值孔径(NA)，同时不牺牲激发的限制，物镜处的SLM的图像应该填充后孔。目标SLM图像中像素间距的大小(称为有效像素间距)取决于中继光学系统(如下图)。 激发的横向视场由可写入SLM的最小相位光栅控制。根据光栅方程sin(θ)= m *λ/ d，可以计算出光线可以偏转的最大角度。这取决于设定的阶数m，波长λ和光栅d的周期，其最小值为有效像素间距的2倍。通过物镜的焦距将测向角度转换为样品的横向位移。下图为用1920x1152液晶空间光调制器在1064nm实现了0度，0.2度，0.4度，0.8度，1.6度的光束偏转。 通过将SLM的分辨率从512 x 512提高到1920 x 1152像素，消除了激励约束与视场之间的限制。对于光遗传学来说，希望维持x和y中激发的点扩散函数(PSF)，因此将SLM的正方形感兴趣区域成像到物镜的后焦平面，有效地将SLM分辨率降低到1152×1152像素。 SLM的像素间距为9.2微米，使得SLM的短轴为10.6毫米。为了使SLM图像的尺寸与物镜的后孔径相匹配，中继光学器件必须将SLM的图像放大，从而将有效像素间距减小到8μm。在0，π衍射图中，最大光栅周期为2个像素，入射波长为940 nm，SLM可以转向的最大角度为3.36°。取物镜焦距为7.2 mm，最大横向位移为零点附近±423μm，或x和y的总横向位移为847μm。这超出了目标可以成像的视野，同时保持目标的全部NA，因此不会牺牲激励约束。此外，通过傅里叶变换，现在可以在样本上创建1152 x 1152个焦点，这只能将目标可解析的焦点利用不到1.16倍。 表1总结了1920 x 1152像素SLM和512 x 512像素SLM的客观规格，光学系统，侧向光束传输规格，其中SLM的图像与SLM的图像与目标后光圈的尺寸以及客观利用率相匹配。 可以使用概述的方程针对不同的SLM模型复制分析。 表1. SLM分辨率与客观规格，中继光学系统的选择以及波长相结合，决定了SLM可以使光线转向的横向视场的规格。 该表比较了当将SLM的图像与物镜的后孔径相匹配时的512×512像素SLM，当将SLM的图像填充到物镜上以牺牲激励约束以匹配转向指向的视场时 目标，1920 x 1152 1152 x 1152像素图像中继到目标。 高分辨率SLM将SLM的射束导向能力与目标视野相匹配，而不会牺牲激励约束。 表2总结了光学系统，1920 x 1152像素SLM和512 x 512像素SLM的光学系统，轴向光束转向规格，其中SLM的图像与物镜后孔径的尺寸相匹配。 表2. SLM分辨率加上客观规格，中继光学元件的选择和波长决定了焦距从客观设计焦距的最大轴向位移的规格。 该表比较了当将SLM的图像与物镜的后孔相匹配时的512×512像素SLM，当SLM在物镜上的图像填充不足时，以及1920×1152，其中1152×1152像素图像是 转达到目标。 |
